《Nature communications》是自然出版集團(tuán)（Nature Publishing Group）旗下的一本開(kāi)放獲?。?/span>Open Access）綜合性學(xué)術(shù)期刊，于2010年創(chuàng)刊。

出版周期：Bimonthly；

影響因子：14.7；

ISSN：2041-1723；

發(fā)文量：7910篇/年；

審稿速度：平均1.0個(gè)月；

版面費(fèi)：USD 6790.00；

一、研究背景與目標(biāo)

B7H3（CD276）是一種高度N-糖基化的膜蛋白，在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，通過(guò)抑制T細(xì)胞功能促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，但具體糖基化位點(diǎn)對(duì)其功能的調(diào)控機(jī)制尚不明確。N-糖基化影響蛋白折疊、運(yùn)輸和降解。異常糖基化可導(dǎo)致蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中積累并通過(guò)ER相關(guān)降解（ERAD）途徑清除。該研究聚焦于免疫檢查點(diǎn)分子B7H3的N -糖基化修飾，揭示了其在腫瘤免疫逃逸中的關(guān)鍵作用，并開(kāi)發(fā)了靶向糖基化B7H3的單克隆抗體，為腫瘤免疫治療提供了新策略。

二、關(guān)鍵技術(shù)總結(jié)

1、通過(guò)CRISPR-Cas9、sgRNA技術(shù)構(gòu)建敲除細(xì)胞系，研究糖基化位點(diǎn)功能；

2、采用WB、IP、IF、FCM的方法檢測(cè)B7H3表達(dá)、定位、泛素化及與其他蛋白互作；

3、構(gòu)建荷瘤小鼠和人源化模型驗(yàn)證B7H3糖基化對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響及抗體治療效果；

4、單克隆抗體篩選技術(shù)及SPR篩選特異性抗體并分析其結(jié)合特性；

5、TCGA數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證B7H3表達(dá)與臨床預(yù)后及免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性；

三、主要研究結(jié)果

1、B7H3的N-糖基化位點(diǎn)對(duì)其細(xì)胞表面定位和蛋白穩(wěn)定性的影響

構(gòu)建人類B7H3的NQ突變體（將天冬酰胺N突變?yōu)楣萢n酰胺Q），包括全突變體8NQ、N91/104/309/322Q（僅這 4 個(gè)位點(diǎn)無(wú)法糖基化）及單一位點(diǎn)恢復(fù)突變體，示意圖顯示野生型B7H3的4對(duì)糖基化位點(diǎn)（N91/309、N104/322、N189/407、N215/433）；在MDA-MB-231和A549細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)突變體，流式分析顯示N91/104/309/322Q突變體的膜結(jié)合B7H3水平與8NQ突變體相似，且mRNA水平無(wú)顯著差異，排除轉(zhuǎn)錄水平影響；小鼠B7H3的N91/104Q 突變體在4T1、E0771、B16F10細(xì)胞中膜表達(dá)量顯著低于野生型，與4NQ 突變體相當(dāng)；用蛋白合成抑制劑CHX處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)N91/104/309/322Q突變體的B7H3降解速率快于野生型，而蛋白酶體抑制劑MG132可逆轉(zhuǎn)該降解。MG132 處理后，N91/104/309/322Q突變體的K48-linked泛素化水平顯著升高，提示通過(guò)ERAD途徑降解。結(jié)果表明，N91/309和 N104/322位點(diǎn)的N-糖基化是B7H3細(xì)胞表面定位和蛋白穩(wěn)定性的主要決定因素，缺失這些糖基化會(huì)導(dǎo)致B7H3在ER中積累并通過(guò)蛋白酶體降解。

圖1、B7H3前體的細(xì)胞表面定位和穩(wěn)定性維持依賴于其N91/N309和N104/N322位點(diǎn)的N-糖基化修飾

2、B7H3糖基化位點(diǎn)N91/309和N104/322突變對(duì)其亞細(xì)胞定位及ER-Golgi轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

隨后，通過(guò)免疫熒光染色和共定位分析，在穩(wěn)定表達(dá)野生型（WT）或糖基化突變型B7H3 的腫瘤細(xì)胞中，觀察B7H3的亞細(xì)胞定位及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、ER-Golgi中間區(qū)（ERGIC）和高爾基體標(biāo)志物的共定位情況。結(jié)果表明，野生型B7H3主要分布于細(xì)胞膜和核周的高爾基體區(qū)域，而N91/104/309/322Q突變體和8NQ突變體的B7H3在細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布，且與ER 標(biāo)記物KDEL的共定位顯著增加，提示B7H3在ER中積累；另外，野生型B7H3可與ERGIC和高爾基體標(biāo)志物（TGN38）共定位，而N91/104/309/322Q突變體和8NQ突變體與上述標(biāo)志物的共定位明顯降低，表明糖基化缺失阻斷了B7H3從ER向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)；

圖2、B7H3在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化缺失會(huì)導(dǎo)致其無(wú)法正常從ER轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，進(jìn)而在ER中積累并被降解。

3、糖基化修飾通過(guò)調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機(jī)制

隨后，通過(guò)免疫沉淀-質(zhì)譜（IP-MS）、蛋白質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)及泛素化分析，在穩(wěn)定表達(dá)野生型（WT）或糖基化突變型B7H3的細(xì)胞中，研究糖基化缺失對(duì)ERAD途徑的激活作用。

圖3、糖基化修飾通過(guò)調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機(jī)制

IP-MS分析結(jié)果表明，N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3與ERAD途徑組分（如 p97、HRD1、SEL1L）的結(jié)合顯著增加，通路富集分析顯示ERAD相關(guān)通路顯著激活；使用 p97 ATP酶抑制劑（NMS-873、CB-5083）或蛋白酶體抑制劑（MG132）處理細(xì)胞后，N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3降解被顯著抑制，表明p97介導(dǎo)的ERAD途徑參與其降解；泛素化水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)N91/104/309/322Q和8NQ突變體的B7H3總泛素化及K48-linked泛素化水平顯著升高，而p97抑制劑處理進(jìn)一步增強(qiáng)該泛素化；免疫共沉淀顯示 N91/104/309/322Q突變體的B7H3與ERAD核心組件HRD1、SEL1L的結(jié)合顯著增強(qiáng)，敲低HRD1或SEL1L后，N91/104/309/322Q突變體的B7H3降解速率顯著降低，K48-linked 泛素化水平也隨之下降，證實(shí)HRD1和SEL1L在ERAD中的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果表明B7H3 在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化缺失會(huì)使其被ERAD途徑識(shí)別，通過(guò)HRD1-SEL1L 復(fù)合物介導(dǎo)K48-linked泛素化，進(jìn)而被p97依賴的蛋白酶體降解。

4、B7H3抑制T細(xì)胞增殖和活化依賴于N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化

CFSE標(biāo)記的人T細(xì)胞與輻照的MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，表達(dá)WT或 N91/104/309/322糖基化B7H3的腫瘤細(xì)胞顯著抑制CD4+和CD8+T 細(xì)胞的增殖（CFSE稀釋減少），而N91/104/309/322Q或8NQ突變體的抑制作用明顯減弱；OT-1 T細(xì)胞與OVA肽負(fù)載的E0771/B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)，糖基化B7H3組的T細(xì)胞增殖抑制更顯著。WT或N91/104糖基化B7H3組的IFN-γ+CD8+T細(xì)胞頻率顯著低于突變體組，表明T細(xì)胞活化受抑制。另外，在小鼠模型中，糖基化B7H3組的穿孔素+和TNF+ CD8+T細(xì)胞比例降低，進(jìn)一步證實(shí) T細(xì)胞效應(yīng)功能被抑制。表達(dá)WT或N91/104糖基化B7H3的腫瘤細(xì)胞與活化T細(xì)胞共培養(yǎng)后，cleaved caspase-3+腫瘤細(xì)胞比例更低，存活腫瘤細(xì)胞更多，而突變體組對(duì)T細(xì)胞殺傷更敏感。此外，糖基化位點(diǎn)突變不影響腫瘤細(xì)胞的體外增殖能力（生長(zhǎng)曲線、集落形成實(shí)驗(yàn)），且不影響PI3K/AKT/mTOR和MAPK等增殖相關(guān)信號(hào)通路，排除了非免疫機(jī)制的影響。這些結(jié)果表明，B7H3在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化是其抑制T細(xì)胞增殖和活化的關(guān)鍵，該修飾通過(guò)維持B7H3的免疫抑制功能，使腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷。這一結(jié)果為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了直接的體外機(jī)制證據(jù)。

圖4、B7H3在N91/309和N104/322位點(diǎn)的糖基化對(duì)其體外抑制T細(xì)胞功能的調(diào)控作用

5、B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化對(duì)體內(nèi)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控作用

隨后，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究了B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化對(duì)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控作用，通過(guò)小鼠荷瘤模型和臨床數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，驗(yàn)證了糖基化B7H3對(duì)腫瘤免疫逃逸的促進(jìn)作用。結(jié)果表明，重構(gòu)N91/104糖基化B7H3的腫瘤生長(zhǎng)顯著快于N91/104Q突變體，而耗竭 CD8+ T細(xì)胞后，兩組腫瘤生長(zhǎng)差異消失，提示依賴CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。并在 C57BL/6小鼠中獲得類似結(jié)果，N91/104糖基化B7H3腫瘤生長(zhǎng)更快，且與CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)減少相關(guān)。此外，N91/104糖基化B7H3腫瘤中，IFN-γ+ CD8+ T、TNF+ CD8+ T、IFN-γ+ CD4+ T 及 TNF+ CD4+ T細(xì)胞比例顯著低于N91/104Q突變體腫瘤，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（FOXP3+ Treg）無(wú)明顯差異。在嚴(yán)重免疫缺陷SCID小鼠中，重構(gòu)N91/104和N91/104Q B7H3的腫瘤生長(zhǎng)無(wú)差異，進(jìn)一步證實(shí)依賴適應(yīng)性免疫。此外，TCGA分析顯示33種人類癌癥中，高B7H3 mRNA表達(dá)與患者總生存期縮短顯著相關(guān)，且B7H3表達(dá)與腫瘤內(nèi)CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化通過(guò)抑制CD8+ T細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。該結(jié)果在小鼠模型和臨床數(shù)據(jù)中均得到驗(yàn)證，為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了體內(nèi)機(jī)制依據(jù)。

圖5、B7H3在N91和N104位點(diǎn)的糖基化通過(guò)抑制CD8+ T細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。

6、糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的篩選和鑒定 

通過(guò)單B細(xì)胞抗體生成技術(shù)篩選特異性識(shí)別糖基化B7H3的單克隆抗體，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、表面等離子體共振（SPR）及免疫印跡等方法驗(yàn)證其結(jié)合特性。用重組人4Ig-B7H3-His 融合蛋白免疫日本白兔，提取脾細(xì)胞通過(guò)單B細(xì)胞技術(shù)生成抗體，經(jīng)ELISA和流式細(xì)胞術(shù)篩選出優(yōu)先結(jié)合N91/309/N104/322糖基化B7H3的Ab-82；驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Ab-82可識(shí)別野生型（WT）和N91/309/N104/322糖基化B7H3，但不結(jié)合N91/309/N104/322Q突變體或去糖基化B7H3（PNGase F處理后）。

圖6、糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的生成過(guò)程及其結(jié)合特異性驗(yàn)證

SPR分析顯示Ab-82與B7H3的解離常數(shù)（KD）為3.0×10?⁹M，表明高親和力結(jié)合，與商業(yè)抗B7H3抗體（eBioscience）相比，Ab-82對(duì) N91/309/N104/322Q突變體的結(jié)合不受HRD1敲除（ERAD抑制）的影響，證實(shí)其依賴糖基化的特異性。免疫沉淀（IP）分析發(fā)現(xiàn)，Ab-82優(yōu)先結(jié)合WT和N91/309/N104/322糖基化 B7H3，不結(jié)合8NQ或N91/309/N104/322Q突變體，而商業(yè)抗體可結(jié)合所有形式的B7H3；Dot blot 驗(yàn)證表明，去糖基化的B7H3蛋白無(wú)法被Ab-82識(shí)別，進(jìn)一步證明其依賴糖基化位點(diǎn)的結(jié)合特性。

7、Ab-82的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制及人源化抗體的療效及作用機(jī)制研究

在4T1-hB7H3 荷瘤小鼠中，Ab-82（0.25–1 mg/kg）顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，且1 mg/kg組腫瘤重量較對(duì)照組降低約70%，無(wú)明顯肝腎功能毒性；而在huPBMC-NOG小鼠中，5 mg/kg Hu-Ab-82使A549腫瘤體積減少約60%，且腫瘤內(nèi)人類CD8+ T細(xì)胞和GZMB+細(xì)胞比例顯著增加。Ab-82處理后，MDA-MB-231和A549細(xì)胞的膜表面B7H3表達(dá)量呈劑量依賴性下降，而商業(yè)抗B7H3抗體不影響膜B7H3水平。pHrodo Red標(biāo)記的Ab-82在37℃下可進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，且內(nèi)吞量隨時(shí)間增加（24 h達(dá)峰值），而低溫（4℃）或內(nèi)吞抑制劑（primaquine）可阻斷該過(guò)程；此外，Ab-82優(yōu)先介導(dǎo)WT和N91/309/N104/322糖基化B7H3的內(nèi)吞，對(duì)8NQ或 N91/309/N104/322Q 突變體的內(nèi)吞作用顯著減弱。同時(shí)，Ab-82處理增加4T1腫瘤中 CD4+/CD8+ T細(xì)胞比例，且GZMB+細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞標(biāo)志物）數(shù)量顯著增多；免疫組化顯示，Ab-82處理組腫瘤組織的B7H3表達(dá)量較對(duì)照組降低約50%，伴隨T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷增強(qiáng)。這表明Ab-82通過(guò)特異性結(jié)合糖基化B7H3，誘導(dǎo)其內(nèi)化與降解，解除B7H3對(duì)T細(xì)胞的抑制，從而激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。人源化抗體Hu-Ab-82在人源化模型中驗(yàn)證了療效與安全性，為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了臨床轉(zhuǎn)化依據(jù)。

四、全文結(jié)論

本研究證實(shí)B7H3的N91/309和N104/322 糖基化位點(diǎn)是其發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵，靶向該位點(diǎn)的抗體Ab-82可通過(guò)誘導(dǎo)B7H3內(nèi)化和降解，激活抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答。這一發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)基于糖基化位點(diǎn)的免疫治療藥物提供了新思路，有望成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Huang Y, Zhong WQ, Yang XY, Shan JL, Zhou L, Li ZL, Guo YQ, Zhang KM, Du T, Zhang HL, Hu BX, Chen YH, Yang D, Feng GK, Tang J, Zhu XF, Deng R. Targeting site-specific N-glycosylated B7H3 induces potent antitumor immunity. Nat Commun. 2025 Apr 14;16(1):3546. doi: 10.1038/s41467-025-58740-3. PMID: 40229277; PMCID: PMC11997214.